使用DOP-PCR試劑盒前期應(yīng)該怎樣處理樣本？
瀏覽次數(shù)：1131發(fā)布日期：2019-10-26
DOP-PCR（Degenerate Oligonucleotide Primer PCR，簡并寡聚核苷酸引物PCR）是擴(kuò)增全基因組的方法之一，它利用中間含有 6 個隨機(jī)堿基的 22nt 引物，通過兩輪 PCR（輪低溫復(fù)性，第二輪高溫復(fù)性）而將模板 DNA 擴(kuò)增。
DOP-PCR試劑盒就是在 DOP-PCR基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化而開發(fā)，它具有下列特點(diǎn)：
1、專門用于高度降解的 DNA，方便，含有除模板 DNA 和引物以外的所有成份，簡化了準(zhǔn)備工作。
2、優(yōu)化的引物濃度，使自連序列和非模板相關(guān)序列的合成。
3、使用高保真酶，降低突變率。
4、長度在 300-1700bp 之間，平均 500bp 左右。
5、模板基因 DNA 用量一般為 10-100pg。
6、所得 PCR 產(chǎn)物可用于 STR 多重?cái)U(kuò)增、比較基因組雜交、單染色體文庫構(gòu)建、基因組圖譜研究等。
7、運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存, 保存期限為 12 個月。不要反復(fù)凍融。
8、自備試劑 DNA 模板、引物、超純水。
9、快速簡便：全程約50分鐘，可測100例左右樣本。
10、取樣量微：本法取樣本量100ul。
11、穩(wěn)定性好：試劑盒2～8℃存放6個月有效。
12、再現(xiàn)性好：變異系數(shù)CV=1.7%。
13、回收試驗(yàn)： X =103.3%。
14、受外界影響因素小：干擾因素少，重復(fù)性強(qiáng)。
15、測試面廣：可測動物組織、紅細(xì)胞以及各種培養(yǎng)細(xì)胞、各種水產(chǎn)等，效果均佳。
DOP-PCR試劑盒所需儀器及自備試劑：
1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀/半自動生化分析儀（比色測定波長為636nm）
2、恒溫水浴箱或氣浴箱 （孵育溫度為37℃）
3、臺式離心機(jī)
4、漩渦混勻器
5、微量移液器
樣本收集與前處理：
紅細(xì)胞：需按照試劑盒中說明書上紅細(xì)胞的測定方法進(jìn)行提取后測定。
動物組織樣本：可用鹽水按重量體積比制備成組織勻漿液，離心取上清測定。
培養(yǎng)細(xì)胞：常用PBS作為勻漿介質(zhì)破碎后離心取上清測定。
具體的樣本前處理：參考我們隨貨發(fā)送的《實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》以及試劑盒中詳細(xì)說明書。
操作流程：
1、酶促反應(yīng)：按說明操作加入樣本100l和混合試劑，37℃準(zhǔn)確反應(yīng)10分鐘
2、加R7，3500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清
3、定磷：取上清液加入定磷劑，室溫靜置2分鐘加終止劑
4、636nm波長，1cm光徑，比色
DOP-PCR擴(kuò)完整基因組的效率不如利用 phi 29 DNA 聚合酶的 MDA，但在擴(kuò)增高度降解的痕量 DNA 方面具有巨大優(yōu)勢，在法醫(yī)鑒定領(lǐng)域具有重要應(yīng)用。
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