支原體PCR檢測試劑盒怎么用？反應要素有哪些？
瀏覽次數：911發布日期：2019-12-16
支原體是一類缺乏細胞壁的原核生物，大小一般在0.3～0.5um之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀，分枝狀等多種態。它不同于細菌，也不同于病毒，種類繁多，分布廣泛，造成的危害相當大，涉及人、動物、植物及昆蟲等多個領域。牛支原體（MycoplasmaBovis）是重要的致病性牛寄生支原體，呈流行趨勢，可引起牛肺炎、關節炎、等多種疾病，發病率達到60%-100%，但病死率不高。牛支原體并不總是引起牛的疾病，在健康或患病的牛身上均可發現其存在。由于牛支原體的疾病表現和對治療和疫苗的反應常發生變化，對它的診斷和控制較為困難。
對牛支原體的檢測，可以通過血清學方法（如免疫熒光法和免疫印跡法），或遺傳學方法（如基于RRS基因的PCR法或寡核苷酸互補配對），進行檢測。后來的研究發現牛支原體的實驗室菌株和野外分離獲得的菌株存在抗原和遺傳學上的變異，對上述檢測方法形成了干擾。
基于穩定的管家基因的PCR可以排除上述變異的干擾。因此，牛支原體PCR檢測試劑盒選取了一個種內變異很小的與DNA修復有關的基因進行PCR鑒定，引物經BLAST驗證為特異性靶向牛支原體，與其他生物的基因組不產生交叉反應。使用本試劑盒檢測了22種不同的牛或羊寄生性支原體，僅有牛支原體產生特異性擴增條帶。而對13個實驗室或野外分離的牛支原體菌株，本試劑盒均可產生特異性擴增條帶。可見本試劑盒具有物種特異性，可用于牛支原體的鑒定和檢測。
本試劑盒利用兩對引物通過巢式PCR法特異性擴增支原體基因組DNA片段，從而實現對支原體的高靈敏度特異性檢測。在編碼16S和23S的保守區DNA上設計一對F1/R1引物，用于擴增16S和23S之間的間隔區，這就是巢式PCR的第一輪PCR(1stPCR)，用于初步鑒定是否有支原體污染；然后在編碼16S和23SrRNA的DNA間隔區的保守區上設計一條F2引物，在編碼23SrRNA的DNA上設計一條R2引物進行巢式PCR的第二輪PCR(2ndPCR)。
每個試劑盒都配有陽性對照，便于確定PCR檢測是否能正常工作，及樣品中是否存在抑制PCR反應的物質。
利用PCR法檢測試劑盒不僅能夠檢出是否有支原體污染，還能根據條帶大小確定支原體種類，可謂是一舉兩得！
使用方法：
一、發酵支原體PCR檢測試劑盒樣品RNA的制備
1、用自選方法抽提病毒樣品RNA。注意：可以選用本公司的一管式病毒RNAout
2、或柱式病毒RNAout。
二：RT（逆轉錄）反應合成cDNA
1.按下表配制RT反應體系（20μL體系）
2.70℃保溫5分鐘變性模板后立即冰浴。
3.嚴格按順序加入6μLRTBuffer（含dNTP）和2μLMMLV逆轉錄酶（含RI），反應終體積為20μL。
4.42℃保溫60分鐘。此步為RT反應。
5.70℃保溫10分鐘以終止反應，然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作為PCR模板使用，丌需要純化。
注意事項：
①加入試劑的順序，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
②使用干凈的塑料容器配置洗滌液。
③按照雞血紅蛋白(HB)ELISA檢測試劑盒說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
④底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
⑤洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
⑥使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
⑦實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。
⑧試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。
⑨不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
支原體PCR檢測試劑盒反應要素：
發酵支原體PCR檢測試劑盒參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則：
①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的堿基，特別是底部及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。
引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。
在線咨詢