DOP-PCR試劑盒重點操作步驟，一定要看
瀏覽次數：876發布日期：2020-03-18
DOP-PCR即Degenerated Oligonucleotide Primed PCR(簡并寡核苷酸引物聚合酶鏈反應)，它與普通PCR的區別在于其使用單一的半簡并引物和低復性溫度，半簡并引物由特定序列+簡并序列+特定序列三部分組成，因此沒有種屬特異性，也跟DNA的復雜性無關，能均勻地擴增真個基因組，尤其適用于痕量DNA樣品的擴增。
產品及特點
本產品可用于不經過E.coli 培養和質粒提取而直接從轉化子中篩選重組子，其原理是直接利用E.coli 菌落作為PCR模板，以識別載體質粒或/和插入片段順序的寡核苷酸為引物對重組子進行篩查，通過PCR產物的有無和片段的大小來判斷外源DNA片段是否被成功克隆到載體質粒之中，使用本產品可以使質粒鑒定過程從兩天縮短到幾小時。
1. 簡單快速，用戶只需要提供PCR引物和E.coli 菌落，不需要培養和質粒提取，整個篩選過程從一天縮短到2-3小時，節約時間和成本。本產品與常用E.coli 菌株和載體兼容。既可小規模篩選，也適用于大規模篩查。
2. 高靈敏度，既可用于高拷貝質粒，也適合于低拷貝質粒。
3. 高特異性，本產品采用了十分有效的辦法控制了培養基上殘留質粒對PCR的影響，使假陽性率低于5%，而絕大部分同類產品的十分容易出現假陽性。
4. PCR反應體系中含有惰性電泳染料，反映完成后可直接上樣電泳，不需另加上樣液。
5. 處理過的菌落樣品低溫長期保存后仍能用于PCR篩查。
6. 性價比高，價格更質粒提取試劑相當，但節約一天時間。
DOP-PCR試劑盒操作步驟：
(一)獲得目的基因
1、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質粒為模板，按基因序列設計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點)，PCR循環獲得所需基因片段。
2、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉錄形成cDNA第一鏈，以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物。
(二)構建重組表達載體
1、DOP-PCR試劑盒(DOP-PCR Kit)載體酶切：將表達質粒用限制性內切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切，酶切產物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
2、PCR產物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
(三)獲得含重組表達質粒的表達菌種
1、 將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，根據重組載體的標志(抗Amp或藍白斑)作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質粒，雙酶切初步鑒定。
2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克隆，重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。
3、 以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞。
(四)誘導表達
1、DOP-PCR試劑盒(DOP-PCR Kit)挑取含重組質粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養。
2、按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中, 37℃震蕩培養至OD600≌0.4-1.0(*0.6，大約需3hr)。
3、取部分液體作為未誘導的對照組,余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續37℃震蕩培養3hr。
4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl 1%SDS重懸，混勻, 70℃10min。
5、離心12000g×1min，取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。
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