免疫熒光是標記免疫技術發展最早的一種，它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術，通過將抗體與一些示蹤物質結合，它利用抗原抗體特異性結合的原理先將已知抗體標上英光素以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受激發光的照射后即會發出一定波長的熒光從而可確定組織中某種抗原的定位進而還可進行定量分析。由于免疫熒光技術特異性強、靈敏度高、快速簡便所以在臨床病理診斷、檢驗中應用較廣。
免疫熒光技術主要步驟:
1、冰凍切片制備:建議用新鮮組織否則組織細胞內部結構破壞易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等防止裂片和脫片。
2、組織切片固定切好片風干后立即用冰丙酮等固定液進行固定5-10min,尤其要較長時間保存的白片,一定要及時固定和適當保存。
3、血清封閉:為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合需要在一抗孵音前先用血清(與二抗來源一致)封閉減弱背暴著色，血清封閉的時間是可以調整的一般10-30min。
4、一抗孵音條件在免疫組化反應中最重要包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵查溫度有幾種4度、室溫。
37度其中4度效果更佳孵音時間這與溫度、抗體濃度有關一般37度1-2h4度過夜(從冰箱拿出后37度復溫45min)。具體條件還要摸索。
5、二抗孵育條件一般室溫或37度30min-1h具體時間需要摸索而濃度一般有工作液若是濃縮液還要摸索濃度一定要避光反應，但在免疫熒光中我們一般先把三抗濃度和孵育時間先定下然后去摸索一抗濃度和邦育時間。最后熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長可能會有大星的游商熒光素殘留需要注意配制時小包裝和并進行適當的商心。
6、復染目的是形成細胞輪廊從而更好地對目標蛋白進行定位，一般常用DAPI復染。
7、封片:為了長期保存我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角,接近封片液近端的拐角先降低直至接觸到液體時為止當發現液體接觸面在不斷彌散時則可以緩慢降低另一拐角這樣一般不會產生氣泡。
8、切片清洗:為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色所以適當地加強清洗(延長時間和增多次數)尤為重要一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次而一抗孵育后的清洗均為5次*5min.
注意事項:
(1)單獨沖洗,防止交叉反應造成污染。
(2)溫柔沖洗,防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式。
(3)沖洗的時間要足夠,才能徹di 洗去結合的物質。
(4)PBS的PH和離子強度的使用和要求(建議PH在7.4-7.6,濃度是0.01M;中性及弱堿性條件有利于免疫復合物的形成,而酸性條件則有利于分解;低離子強度有利于免疫復合物的形成,而高離子強度則有利于分解。
9、拍照有條件的話更好立即拍照若不能及時拍照也要封好片和用指甲油封固,保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作不要隨意改變程序應在暗室中進行檢查防止紫外線對眼睛的攝害在調救光源時應戴上防護眼鏡檢查時間每次以1~2h為宜超過90min.超高壓錄燈發光強度逐漸下降熒光減弱標本受紫外線照射3~5min后熒光也明顯減弱或褪色激發光長時間的照射,會發生熒光的衰減和淬滅現象:所以最多不得超過2~3h熒光顯微鏡光源壽命有限標本應集中檢查，以節省時間,保護光源。天熱時應加電扇散熱降溫新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再啟用時須待燈光充分冷卻后才能點燃。中應避免數次點燃光源。關閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后標本染色后立即觀察因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚之烯塑料袋中4℃保存可延緩熒光減弱時間,防止封裱劑蒸發,使用的玻片等載體都必須厚度均勻無明顯的自發熒光如果使用油鏡還必須保證鏡油為無熒光鏡油電源更好裝穩壓器,否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命也會影響鏡檢的效果。
除了這些基本步驟，以下建議可以幫助您獲得更好的實驗結果。
1、細胞固定和通透
為達到最佳的檢測效果，細胞需要經過固定和通透。這些步驟非常關鍵，細胞和抗原需要保證最佳的結構，并利于抗體與抗原結合。通常情況下，需要通過以下步驟得以實現：細胞用2%-4%多聚甲醛固定，之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100進行通透。前者是比較溫柔的處理，但是對于核內抗原可能無效，需要用到Triton。使用皂角苷進行通透時，要注意它會引起細胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每個抗體孵育環節都需要進行通透。另外，細胞可以用冰甲醇進行同時固定和通透，可以避免去垢劑的使用。
2、抗體特異性
免疫熒光需要用到特異性非常強的抗體，可以避免高背景和不理想的蛋白定位結果。在大多數情況下，純化抗體的效果很好，但是正確的對照可以幫助精準定位抗原。使用只有二抗染色的片子作為陰性對照，有利于減少降低背景干擾。
3、合適的抗體稀釋比例
通過優化抗體稀釋比例來優化染色，通常情況下1ug/ml的純化抗體或者1:100-1:1000的抗血清足夠達到特異性染色的結果。但在能保證低背景染色的前提下，可以通過增加濃度來提高信號強度。如果是第1次使用該抗體或測定某抗原，強烈建議濃度梯度實驗。
4、優化緩沖液和封閉劑
盡管很多抗原在常見的Buffer如PBS中可以很好的被染色，但是對于某些目的抗原，更換一下含有不同離子的緩沖液，比如鈣、鎂、鉀等，可以帶來很大程度上的改善。Rockland可提供優化過的IHC用封閉緩沖液，同樣適用于熒光染色實驗。
5、選擇正確的二抗
如果您需要做免疫實驗，我們強烈建議您選擇進行過預吸附的二抗進行單染實驗；如果是雙重甚至是多重染色，那么必須使用預吸附的二抗。同時，請優先選擇來自同一物種的二抗。
6、使用合適的細胞密度
選擇合適的細胞數量進行染色，當細胞數量過多時，細胞結構不好，導致染色背景深，低細胞密度，會使細胞貼壁不佳，狀態不好。
7、多重染色
對同一樣本進行兩個不同抗原的檢測時，可以用各自的抗體進行同時染色，但要求兩個一抗的種屬來源不同，標記物不同，而二抗的種屬來源需保持一致。
8、降低背景
高背景是免疫熒光常見的問題，解決此問題可以用二抗來源的正常血清代替BSA做封閉液，降低抗體濃度，增加洗滌次數，洗滌至少三次，每次五分鐘，推薦洗滌液為PBS+0.05%Tween。
9、封片
作為免疫熒光的最后一步，可以提高折射率，保護樣品。
10、數據分析
觀察整體樣片時，選擇具有代表性的細胞進行數據獲取與分析。
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