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                                      流式細胞術常見問題說明

上海撫生將進一步加強人才經營、產品經營，不斷提升企業的核心竟爭力，實現具有產業體系、知識化創業團隊的化的公司，服務于生命科學領域，迎接世界經濟一體化所帶來的機遇與挑戰。小編解答 流式細胞術常見問題說明及方法。

1、流式細胞儀上的FL2-W FL2-A FL2-H 分別是做什么的？

FL2-W是只檢測熒光的脈沖寬度， FL2-H是指脈沖高度。通常在做細胞周期分析時應用，用于去除粘連細胞。

2、流式同型對照怎樣選擇？

同型對照（Isotype Control）：使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產生的背景染色。如果一抗是多抗，可以用an normal serum（與一抗相同的正常血清） （must be the same species as primary antibody）。This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.這個可以咨詢試劑商。同型對照為免疫熒光標記中的陰性對照。由于熒光標記單抗的組來源不同，應選用相同來源的未標記單抗作為同型對照來調整背景染色。舉個例子：比如檢測一抗為單抗的mouse anti rat CD11b，clone OX-42 purified IgG，那么它的isotype 是mouse IgG2a， 所以可以用purified（純化的） mouse IgG2a來做OX-42的同型對照（Isotype Control）。一般的的生物技術公司和國內的代理都有出售。

同型對照：是指與MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亞類，若使用直接免疫熒光染色法，同型對照也應標記熒光色素，如IgG1 FITC、IgG2ａ、PE等。主要考慮了細胞的自發熒光、FC受體介導的抗體結合和非特異性抗體結合等影響因素。此外，同型對照與MoAb所標記的熒光色素、濃度、F：P比值（標記的熒光色素與免疫球蛋白分子的比值）應該相同為*，這對準確設定陰性與陽性細胞的界標有重要意義，切忌使用與MoAb不相匹配的同型對照，為同一實驗室、采用相同工藝或方法制備（如同一品牌）的產品。

3、流式細胞技術測定細胞內游離鈣濃度為何要使用氯化鈣？

在文獻及其他專業網zhan中都有測定游離鈣的方法，具體如下：

（1） 鈣熒光探針負載；

（2）隨機測定每管細胞懸液樣品（以下簡稱樣品）的單個細胞的熒光強度，記為F值。

（3）加入10%Triton X 100，（破膜用）；加入1 mmol/L氯化鈣，（問題所在），吹打均勻，孵育1~10min，測定熒光即Fmax值。

（4）加入EGTA，20%26mu;l（鈣螯合劑），孵育1~10min，激發波長488nm測定熒光，即Fmin值。

因為正常血漿中Ca2＋濃度是1mM，細胞外液的Ca2＋對細胞內Ca2＋有影響。加0.1%triton是增加膜通透性，使細胞外Ca2＋進入細胞內，作為大值。加EGTA是為了螯合Ca2＋，作為小值.環境中細胞內鈣離子濃度遠低于細胞外液（大約1：10000），細胞膜對鈣的通透性變化對細胞內鈣影響很大。